一、介紹
宏基因組 ( Metagenome) 指特定環境下所有生物遺傳物質的總和。它包含瞭可培養的和未可培養的微生物的基因。一般從環境樣品中提取基因組DNA, 進行高通量測序，從而分析微生物多樣性、種群結構、功能信息、與環境之間的關系等。
宏基因組的分析目前主要包括三種方法：基於組裝分析、基於reads分析、基於bin分析。
下面我們介紹基於bin的分析方法。
二、分析流程介紹
宏基因組分箱（Binning）是將序列組裝得到的Contigs按物種分開歸類的過程。宏基因組分箱技術有助於獲得不可培養微生物的全基因組序列，獲得新物種的基因組序列和功能，預測未知物種的培養方法等等。
分箱軟件通常基於GC含量、核苷酸頻率、關鍵的單拷貝基因序列等組成性特征；豐度分佈差異，認為源自同一基因組的序列 (contigs)，在同一樣本中應具有一致的豐度，而在不同的樣本之間，它們又應該具有相似的豐度分佈；兩種策略進行分箱。
基於Binning的宏基因組分析流程，數據分析從下機原始序列開始，首先對原始序列進行去接頭、 質量剪切以及去除污染等優化處理。然後使用優質序列進行拼接組裝得到Contigs；使用metabat2和maxbin2軟件分別對每個樣本的Contigs進行分箱；不同軟件分箱得到的bin進行合並（binning_refiner）、提純（MAGpurify）；然後將所有樣優化後的bin進行去冗餘（dRep）；而後分別從物種和功能方面進行信息統計。
三、詳細流程
1. 數據質量控制，為瞭提高後續分析質量和可靠性，對原始測序數據進行以下清洗處理， 獲取用於後續分析的有效數據(Clean Data)。具體處理步驟如下：使用fastp軟件去除質量低的reads，過濾掉質控後長度較低的reads，同時去掉接頭序列；如果樣品來源於宿主（比如人或動物的糞便），而且該宿主本身的基因組已被發表， 則通過軟件Bowtie2軟件將reads比對宿主DNA序列，並去除比對相似性高的污染reads；
2. 序列組裝： 使用Megahit軟件使用不同kmer對優化序列進行組裝得到Contigs；
3. Bin生成：采用metaWRAP環境中binning模塊的metabat2和maxbin2方法對contig進行分箱。
4. 合並不同軟件得到的bin：采用binning_refiner軟件將兩個軟件生成的bin進行合並，重新生成bin，並提純bin。
5. 去冗餘和篩選：合並所有樣本中得到的bins，用CheckM中的lineage_wf流程評估bins的完成度和污染度，並用dRep軟件對bins進行去冗餘。
6. Bin豐度計算：在metaWRAP環境中，使用metaWRAP的quant_bins模塊計算每個Bin的豐度。
7. Bin物種註釋：使用 PhyloPhlAn3軟件將bins與SGB.Jul20比對，獲取每個bin的物種分類信息。
8. Bin功能註釋：基於Prokka軟件得到的蛋白序列信息，用emapper軟件和eggNOG數據庫進行比對，得到COG、KEGG、CAZy、GO的信息，采用ARI軟件和CARD數據庫進行比對得到抗性基因信息，進行基因個數的統計，並進行可視化。
四、主要分析結果
1、Bin信息統計
Bin信息統計（示例）
第一列：bin編號；第二列：bin完成度；第三列：bin污染度；第四列：Contig N50；第五列：Contig N90；第六列：一個Bin的所有Contig長度之和，即該基因組草圖的總長度；第七列：GC含量是指一個Bin中GC堿基占總堿基的比例。
2、GC-depth圖
Contig GC含量和depth深度數據即可進行可視化，繪制Bin中每個contig的散點圖。此圖可以用來判斷分箱效果和污染情況。
Binned contigs可視化
註：橫坐標是contig的GC含量；縱坐標是contig depth；一個點代表一個contig，相同顏色的contig來自同一個bin。
3、GOLevel2基因數統計
GO提供瞭一系列的語義（terms）用於描繪基因、基因產物的特點，這些語義通過三個概念維度展開：細胞學組件（Cellular Component）用於描述某個節點的亞細胞結構、位置和大分子復合物；分子功能（molecular function），用於描述基因以及基因產物的功能；生物學途徑（biological process）指的是分子功能的有序組合以實現更復雜的生物功能，
GO註釋統計圖
註：該圖說明的是其中一個bin預測基因所屬GO的情況；縱坐標是數量；橫坐標是GO；顏色是GO分類；柱子越高，該GO中包含的預測基因(CDS)越多。
4、KEGGLevel2基因數統計
KEGG PATHWAY 數據庫中，將生物代謝通路劃分為 6 類，分別為：細胞過程（Cellular Processes）、環境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、人類疾病（Human Diseases）、新陳代謝（Metabolism）、生物體系統（Organismal Systems），其中每類又被系統分類為二、三、四層。第二層目前包括有 57個種子 pathway；第三層即為其代謝通路圖；第四層為每個代謝通路圖的具體註釋信息。
KEGG pathway level2水平CDS數量可視化
註：橫坐標是KEGG level2水平CDS數量；縱坐標是KEGG level 2名稱；顏色用於區分KEGG level 1的類型。
4、COG各類別基因數統計
COG，即Clusters of Orthologous Groups of proteins（同源蛋白簇）。COG是由NCBI創建並維護的蛋白數據庫，根據細菌、藻類和真核生物完整基因組的編碼蛋白系統進化關系分類構建而成。通過比對可以將某個蛋白序列註釋到某一個COG中，每一簇COG由直系同源序列構成，從而可以推測該序列的功能。
註：縱坐標是COG level 2分類（字母表示，共26種分類）；橫坐標是註釋到的CDS計數；顏色是COG level 1分類（四大類，分別是：細胞過程和信號傳遞、信息儲存和加工、代謝和尚未明確）；柱子越長，屬於該分類的預測基因越多。
4、Bin進化樹
使用 PhyloPhlAn3軟件將Bin與SGB.Jul20比對，以獲取Bin之間的進化關系樹和物種註釋。圖中的熱圖展示的是Bin相對豐度信息， 分支不同顏色表示門分類信息。
5、Bin圈圖可視化
利用每個Bin（基於contig）的Prokka蛋白預測信息，功能區註釋信息（含正負鏈、CDS、RNA類型等信息），以及GC content、GC skew的統計結果繪制Circos圈圖，直觀展示整個Bin的功能註釋信息。
註：展示長度最長的20條contigs。從外到內，第一圈表示屬於該bin的contigs，長度用刻度表示，單位為Mbp；第二圈用不同顏色區分contigs上的正鏈和負鏈；第三圈用不同顏色的三角標出tRNA, rRNA以及CDS(編碼蛋白)的編碼區；第四圈標註contigs分段（每1kb）GC含量，其中用不同顏色區分大於和小於所有contigs分段GC含量總平均值；第六圈標註contigs 分段(每1kb)GC skew值，大於和小於0用不同顏色區分。
