畢赤酵母（Pichia Pastoris）是一種甲醇營養型酵母菌。它於1960年代被發現，其特征是將甲醇作為且是唯一的碳和能量的來源。經過多年研究，畢赤酵母被廣泛用於生物化學研究和生物技術行業，正在逐漸成為一種重要的重組蛋白表達生產系統。雖然畢赤酵母的應用歷史和名望遠不及上千年前就被人類發現的釀酒酵母，不過相比釀酒酵母，畢赤酵母優越的性能使其在生物制藥中的應用正在逐步超過釀酒酵母。下表是FDA審批的部分應用酵母表達的生物制品清單，涉及激素、疫苗、血液相關制品、細胞因子和酶等。

FDA-approved biopharmaceuticals produced in yeast cells (adapted from Walsh, 2018).[1]

起初釀酒酵母也被生物制藥界寄予厚望，希望這一真核微生物能夠擁有媲美大腸桿菌的重組蛋白產量和生產成本，還擁有翻譯後修飾如糖基化、更好的折疊、分泌系統等真核細胞的體系。不過“理想很豐滿、現實很骨感”，釀酒酵母表達系統應用於制藥，最初的發展並不順利，並且一度給整個酵母在生物制藥中的發展留下瞭陰影，以至於酵母在生物制藥中的應用在20世紀80年代才開始緩慢起步。

最初酵母重組表達在生物制藥中不順利主要是由於以下一些問題。最初應用釀酒酵母表達的幾個重組蛋白結果不太理想，同時釀酒酵母的搖瓶工藝到發酵工藝的放大技術轉移大多也都不理想。此外釀酒酵母的N連接-糖基化與哺乳動物細胞有很大差異，酵母將甘露糖引入到糖基化中，長度可以達到50~150，長度差異性或異質性很大，且糖鏈的核心寡糖含有α-1,3糖苷鍵。甘露糖側鏈和α-1,3糖苷鍵糖鏈在人體內都會引起排異反應，會導致制品血清半衰期明顯縮短，更重要的是給制品的生物安全性帶來巨大隱患。

Major N-glycosylation pathways in humans and yeast.[2]

不過隨著20世紀70年代以來分子生物學技術的快速突破和發展，人們也自然想到瞭通過遺傳改造優化酵母的糖基化類型和方式，將糖基化進行人源化改造，這也是優化酵母重組表達系統的一個方向。

同時，人們把目光投向瞭新的酵母菌株，此時畢赤酵母以擁有眾多生物表達系統的優點脫穎而出。

1、和釀酒酵母相比，畢赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面具有優勢。釀酒酵母與畢赤酵母不同，N-連接糖基化主要是高甘露糖形式。釀酒酵母側鏈寡糖通常會添加50~150個甘露糖殘基，長度差別很大，修飾後的蛋白異質性高；相比而言，畢赤酵母平均每條側鏈為8-14個甘露糖殘基，長度變化小，修飾後的蛋白一致性高。而且畢赤酵母不產生具有免疫原性的α-1,3糖苷鍵，所表達的生物制品安全性更好。

2、、和釀酒酵母相比，畢赤酵母在表達調控上擁有明顯優勢。作為甲醇營養型酵母，畢赤酵母可以使用AOX1啟動子表達外源蛋白，這是一種非常嚴謹控制的高表達誘導體系，不會存在表達泄露問題，同時表達水平也很高，能比釀酒酵母高10~100倍，簡直媲美大腸桿菌表達系統。此外還含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAP）啟動子，用於高水平的組成型表達。釀酒酵母表達載體是以質粒形式，畢赤酵母則以整合進入基因組的方式，菌株表達穩定性高、可靠性強。

3和其它物種的表達系統相比，畢赤酵母的優勢同樣明顯，其兼具原核表達系統和真核表達系統的優點。與最常用的E.coli和CHO表達系統相比，其具體對比如下表：

Basic characteristics of different host systems for the expression of recombinant proteins.[3]

由上表可知，雖然在單獨對比中E.coli和CHO表達系統都比畢赤酵母有一些優勢，但總體比較而言，畢赤酵母具備瞭微生物的培養簡單經濟、支持高密度發酵、表達量高的優點，同時具備瞭哺乳動物細胞的蛋白翻譯後修飾、正確折疊、分泌表達等優勢。綜上，畢赤酵母的優勢是：培養簡單經濟、具備折疊和翻譯後修飾、表達產量高、產物避免瞭內毒素和病毒污染等。

4、和CHO細胞表達平臺的基因組整合表達一樣，畢赤酵母同樣可以應用加壓篩選進行多拷貝重組子的篩選和工程菌株建庫，不過畢赤酵母通過單交叉串聯重組到酵母染色體的單一固定位點，生產用細胞株的遺傳穩定性更好。

那麼常用的畢赤酵母有哪些呢？接下來我們按照突變體類型進行劃分，畢赤酵母含有AOX1和AOX2兩個醇氧化酶基因，也正是由於此兩個基因的存在使得畢赤酵母能夠以甲醇做為營養和能量物質，不過AOX1產物酶活高起主要功能，AOX2產物酶活低。當AOX1突變後，畢赤酵母雖然也可以在含甲醇培養基中生長，不過生長速率下降很多。因此對於不同的AOX1和AOX2基因型，可將酵母菌株分為Mut+（含有AOX1和AOX2）、MutS（敲除AOX1，保留AOX2）和Mut-（敲除AOX1和AOX2）。常用的畢赤酵母菌株的Mut分型如下：

畢赤酵母既可以表達分泌蛋白，也可表達胞內蛋白，而被廣泛應用於亞單位疫苗的表達制備。近年來的進展情況見下方三個表格，表中描述瞭表達載體、Marker基因、表達菌株和目的蛋白等信息。

Common Pichia pastoris expression vectors for the production of secretory proteins.[3]Common Pichia pastoris expression vectors for the production of intracellular proteins.[3]Recombinant subunit vaccine expressed in Pichia pastoris.[3]

2020年2月21日，FDA批準丹麥靈北制藥的CGRP抗體Eptinezumab上市，商品名為Vyepti，用於預防偏頭痛。Eptinezumab是通過重組DNA技術在畢赤酵母細胞中表達而得，是首個酵母表達的單抗藥物。這項工作為酵母在抗體生產中的應用和抗體藥物生產成本控制打開一片新的藍海。在醫藥企業競爭激烈、產品同質化嚴重、國傢藥物集采的背景下，提高藥品研發成功率、降低藥品生產成本、提高公司核心競爭力，都是醫藥公司面臨的難題。隨著畢赤酵母表達系統的完善和成熟，其生產成本低、發酵周期短、易於培養、操作簡單方便、可大規模生產、基因遺傳穩定，蛋白翻譯後修飾等特點，受到越來越多研究機構和醫藥生產企業的青睞。

上海領康時代酵母表達平臺

公司建有畢赤酵母、釀酒酵母重組蛋白表達平臺，可實現從Gene到IND，以及早期臨床樣品制備的全流程開發服務，開發周期9-15個月。建設有符合GMP要求的1條500L微生物發酵和純化的成熟生產線，可提供10L-50L、500L等規模的原液制備。

領康時代酵母表達平臺工作流程圖

領康時代微生物表達平臺

參考文獻

[1] Yeasts as Biopharmaceutical Production Platforms. Front Fungal Biol. 2021.

[2] The humanization of N-glycosylation pathways in yeast. Nat Rev microbiol. 2005; 3(2): 119-28.

[3] Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins. J Cell Physiol. 2020; 235(9): 5867-5881.