在細胞內，信息的傳遞主要依靠分子-分子相互作用的化學方式，同時也伴有一些諸如電、光、機械壓力等物理方式。免疫細胞需要及時對抗原刺激做出響應，因此它們擁有一系列復雜的信號傳導通路（signal transduction pathways），可以實現激活、增殖、分泌蛋白、凋亡等過程。信號傳導任何一個環節的錯誤都會對全局造成災難性後果。本章節將主要介紹B細胞、T細胞的信號傳導方式，包括胞內的分子通路和細胞間分泌的細胞因子等。

蛋白激酶與磷酸化

免疫細胞的跨膜受體是將細胞外信息傳遞到胞內的使者。常見的淋巴細胞跨膜蛋白如BCR、TCR以及許多固有免疫受體如TLR等都需要和胞外的抗原（或者其他刺激因子）結合，發生構象變化影響到胞內結構，從而與下一級信號分子發生作用。信號分子與信號分子之間的作用不僅僅是簡單地結合，大多數時候還會發生一些“反應”。最常見的反應方式是通過蛋白上某些特定氨基酸的磷酸化（phosphorylation）來實現的。磷酸化是蛋白質上最常見的翻譯後修飾（post-translational modification，PTM），絕大多數磷酸化發生在酪氨酸Tyr、絲氨酸Ser以及蘇氨酸Thr三種氨基酸上。激酶（kinase）是蛋白磷酸化的執行者，它們以ATP、GTP等含有高能磷酸鍵的小分子為供體（donor），催化特定底物蛋白的磷酸化。與激酶對應的是磷酸酶（phosphotase），它們負責去除特定磷酸化修飾。經典信號傳導過程常常涉及多個激酶級聯（cascade）反應，如A磷酸化B、B磷酸化C、C磷酸化D等等。這種多級傳遞的方式可以將原本微弱的信號放大，使細胞對外界刺激更加敏感。在多級傳遞反應中，有一類蛋白能被激酶磷酸化，但不能作為激酶參與下一級反應，這類蛋白被稱為骨架蛋白(scaffold)或者轉化蛋白(adaptor)，其作用是被磷酸化後招募其他信號蛋白，從而傳遞信號。

許多受體的胞內部分具有酶活功能，例如酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTK）。這類跨膜蛋白在未激活狀態下一般以單體形式存在，與膜外信號分子結合後發生二聚，位於胞內的激酶結構域構象發生改變而被激活。胞內的酪氨酸激酶域能催化臨近蛋白的Tyr磷酸化，將信號傳導到下一蛋白分子上。另外一類受體本身沒有胞內的酪氨酸激酶的結構域（即沒有激酶酶活），而是通過非共價結合的方式與其他酪氨酸激酶結合完成信號傳導，這種受體被叫做酪氨酸磷酸化受體（non-catalytic tyrosine phosphorylated receptors）。常見的淋巴細胞受體如BCR、TCR等都屬於這一類。

RTK激活的機制，以EGFR為例

由於信號分子傳遞需要蛋白-蛋白相互作用，因此這些信號蛋白總有一些保守的結構域以與其他蛋白接觸。在免疫受體種常見的結構域包括SH2 (Src Homology 2）、SH3、PH（Pleckstrin Homology）、PX（phagocytic oxidase）等等。SH2/3最早發現於原癌基因Src（也是一種磷酸激酶）中，其中SH2識別pYXXZ motif （Z=E or Q），SH3識別PXXP motif，當Src發生磷酸化修飾，SH2與關鍵磷酸化酪氨酸結合位點發生改變而導致蛋白整體構象變化（如下圖所示）。

Src蛋白激活前後結構變化：關鍵位點Y530去磷酸化使得SH2脫離蛋白C端，進一步導致SH3與PXXP linker解離。https://doi.org/10.1111/fcp.12097

PH和PX結構域則主要結合脂酰磷酸肌醇（phosphatidylinositides，PI）,這是一類附著在細胞膜上的磷脂類衍生物。如下圖所示，PIP及其衍生物由親脂的2條脂肪酸（鑲嵌在細胞膜內）、甘油骨架、磷酸和肌醇幾個部分構成，肌醇上有6個羥基，可被磷酸化修飾。PIP1、PIP2、PIP3依次代表一磷酸化、二磷酸化和三磷酸化的脂酰磷酸肌醇。當細胞接受到來自外界的刺激信號時，一種叫PI3K的激酶會將PIP2磷酸化成PIP3，這是一種重要的第二信使分子，它能被Akt蛋白（又叫protein kinase B，PKB）的PH域特異性結合，從而啟動一系列糖代謝、細胞增殖相關基因的轉錄。另外一類含PH域的蛋白是PLC（phospholipase C，磷脂水解酶C），其功能是水解PIP產生遊離的磷酸肌醇（IP）。已知的哺乳動物PLC共13種，分成6個亞型（β, γ, δ, ε, ζ, η）。例如PLCγ可以水解PIP2，產生的1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（Diacylglycerol, DAG）。IP3和DAG是兩個重要的第二信使分子，將會在後面具體介紹。另外，C1結構域可以識別DAG。

磷酸肌醇及其衍生物的生化合成通路。圖片來源 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008167

除上述結構外，免疫細胞受體的胞內域中還存在兩種比較常見的氨基酸序列，分別是ITAM和ITIM（Immunoreceptor Tyrosine-based Activation/Inhibitory Motif）ITAM的中文名叫免疫受體酪氨酸激活序列，對應的氨基酸序列為YxxL/I x(6-8) YxxL/I（x代表任意氨基酸，兩個YxxL/I之間相隔6-8個氨基酸）；ITIM中文為免疫受體酪氨酸抑制序列，氨基酸序列為S/I/V/L xYxx I/V/L。顧名思義，ITAM的存在可以激活免疫細胞，ITIM則抑制免疫細胞（雖然某些特殊情況ITAM起抑制作用）。從分子機制上看，ITAM上的酪氨酸磷酸化後主要招募含有SH2的酪氨酸激酶蛋白（如Syk，ZAP-70），而ITIM被磷酸化後招募SHP-1/2等磷酸水解酶，起到抑制激酶活性的作用。

另一類不受酪氨酸磷酸化調控的常見跨膜信號轉導受體叫做G蛋白偶聯受體(G protein coupled receptor，GPCR)，這類受體的共同結構特點是有7個跨膜α螺旋結構域，且C端和5-6號α螺旋之間的胞內區域存在G蛋白（鳥苷酸結合蛋白）結合位點。大多數G蛋白由α，β和γ三個亞基組成，可以結合GDP（失活狀態）或者GTP（激活狀態）。當GPCR結合對應小分子受體時（如下圖中的腎上腺素），胞內結構構象改變，露出G蛋白結合位點，G蛋白與GPCR結合後將其結合的GDP拋棄換成GTP，此時G蛋白被激活，磷酸化下遊的信號蛋白（激酶），或者產生信號小分子（例如cAMP，又稱為第二信使），同時G蛋白自身將GTP水解為GDP而失活。中性粒細胞表面識別細菌代謝產物的fMet受體就屬於GPCR。

腎上腺素受體激活方式，https://doi.org/10.1073/pnas.1810316115

除瞭含3個亞基的G蛋白以外，還有一種特殊的單體G蛋白，稱為小G蛋白(small G protein)，比如著名的原癌基因Ras。和G蛋白一樣，小G蛋白也隨時在結合GDP的失活狀態和結合GTP的激活狀態之間來回切換。輔助小G蛋白將GDP換稱GTP的一類蛋白叫做鳥苷交換因子（guanine-nucleotide exchange factor，GEF），比如Sos是Ras蛋白的一個GEF，可以將Ras激活。與GEF功能相反，有一類蛋白專門促進G蛋白水解GTP，稱為GTPase-activating proteins（GAP），這類蛋白使得G蛋白結合底物變成GDP而回到失活狀態。許多G蛋白表面都帶有脂肪酸（棕櫚酰化，異戊二烯化等）的翻譯後修飾，這使得它們可以附著在細胞膜表面。

Ras的激活和失活。 DOI: 10.7554/eLife.12435

B細胞信號傳導通路

https://www.cellsignal.com/

我們以B細胞為例，來聊一下信號傳導過程。B細胞的主要抗原受體為BCR，另外CD19/CD21 /CD81等也參與感知抗原刺激的信號傳導。在之前已經提到過，BCR除瞭免疫球蛋白重鏈、輕鏈外，還有兩個輔助受體Igα和Igβ（又叫CD79a和CD79b），兩者通過二硫鍵連接構成瞭CD79復合物，在胞內Igα和Igβ各有一個ITAM。B細胞內負責磷酸化ITAM的激酶有三種，分別是Blk, Fyn, Lyn，它們均屬於Src傢族酪氨酸磷酸激酶。當BCR識別抗原發生交聯時，兩個CD79距離變近，導致這些激酶被激活而磷酸化ITAM；磷酸化的ITAM立刻招募Syk蛋白（spleen tyrosine kinase），一種B細胞特有的激酶。Syk是BCR信號通路的關鍵激酶，含有兩個SH2結構域，正好識別ITAM上的兩個pTyr，能識別並磷酸化下遊的多種蛋白，同時自身也能被磷酸化。

CD19/CD21/CD81復合物又被稱為B細胞輔助受體（B cell co-receptor），功能和T細胞的CD4/CD8類似。CD21的另一個名字叫做補體受體2（complement receptor 2, CR2），能識別補體C3d片段。當抗原同時被補體標記後形成共刺激信號可增強B細胞響應。CD19是B細胞特異的分子（常作為B細胞marker），其胞內域含有多個酪氨酸，可以被Syk等酶磷酸化而招募更多Src傢族激酶。

B細胞輔助受體激活示意圖（Janeway Im）

Syk下遊的主要目標為BTK，PI3K，PLCγ，SLP-65(又叫BLNK)，Vav等。BLNK是B細胞信號通路中的一個骨架蛋白，在被磷酸化後可結合多種含SH2的蛋白，例如PLCγ、Grb2等等。Syk, BTK也可以磷酸化PLCγ，總之許多激酶通過不同途徑把信號傳到瞭PLCγ上。

在上面提到瞭，PLCγ的功能是將PIP2水解為IP3和DAG，而IP3可以從細胞質中擴散到內質網外膜，結合鈣離子通道，使ER內的鈣離子外流。（正常情況下，由於離子泵不斷將Ca2+泵出，細胞質內的Ca2+濃度應該非常低，而ER內腔則儲存瞭大量Ca2+）ER內腔的Ca2+濃度降低導致內質網膜蛋白STIM1寡聚與質膜上的ORAI1（一種質膜鈣離子通道，又叫做calcium release activated calcium channel, CRAC）結合，促使ORAI1打開並讓細胞外液的Ca2+流入細胞質。在兩者共同作用下，細胞質內的Ca2+濃度上升，觸發NFAT（nuclear factor of activated T cell，實際上不僅在T細胞也在其他細胞中表達）。NFAT在失活狀態下位於細胞質中，其序列上的Ser/Thr位點被磷酸化，因此不能被核轉運受體識別。當細胞質中鈣離子濃度增加時，會激活鈣調蛋白Calmodulin（CaM）使其構象改變。鈣調蛋白可結合鈣調神經磷酸酶Calcineurin（CaN），CaN可以將NFAT上的磷酸化修飾水解，從而使其進入細胞核內啟動下遊基因轉錄。cyclosporin A）CsA和FK506是最常用的兩種calcineurin小分子抑制劑。

鈣離子信號通路（T細胞）adapted from https://doi.org/10.12688/f1000research.13426.1

DAG作為第二信使分子，其主要招募的蛋白為PKC以及RasGRP。RasGRP是Ras的一個鳥苷交換因子，含有C1結構域，用來激活附著於質膜上的Ras蛋白。其他信號分子，如BLNK招募的SOS也可以激活Ras。Ras激活後，下遊依次激活Raf、Mek、Erk三個激酶，這些激酶依賴於Ser/Thr磷酸化。其中Erk屬於MAPK傢族蛋白（mitogen-activated protein kinase）；Raf和Mek也被叫做MAPKKK和MAPKK（禁止套娃！）這樣Ras激活產生的信號便像接力一樣一棒又一棒地傳到瞭最後，MAPK進入細胞核，磷酸化對應轉錄因子。Erk主要磷酸化Elk-1/2，Elk-1作為轉錄因子可啟動c-Fos的表達；而另一種同屬於MAPK傢族的激酶JNK磷酸化轉錄因子c-Jun，和c-Fos一起，兩者組成瞭Jun-Fos轉錄復合物，也叫AP-1。

Ras信號通路。https://doi.org/10.1038/ni.2941

蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）是另外一種含C1結構域的分子，在B細胞中存在的亞型為PKC-β和δ。PKC首先磷酸化一種叫CARMA1的骨架蛋白，這種蛋白隨後會和BCL10、MALT1在細胞膜內側形成復合物，招募TRAF-6 (TNF receptor associated factor)。TRAF傢族蛋白很多都是E3泛素連接酶，它們自身被泛素化，然後以多泛素化修飾為模板招募TAK1/TAB1/2復合物。TAK1可以磷酸化IKK復合物（IκB kinase），這是一種由IKKα，β，γ（又叫NEMO）三個亞基組成的復合物；IKKγ可以結合泛素化修飾，而IKKβ被TAK1磷酸化激活後繼續磷酸化IκB (inhibitor of κB) 。IκB原本結合轉錄因子NFκB（由兩個亞基p50和p65 (Rel A)組成）形成穩定的復合物，在未激活條件下位於細胞質內，磷酸化後IκB立刻被泛素化降解，使NFκB轉錄因子入核，啟動細胞因子相關基因轉錄。這就是經典的NFκB信號通路。NFκB通路不僅可以由PKC觸發，幾乎所有的免疫細胞受體（如TLR、BCR、TCR、TNF、CD40L等）激活後下遊都能觸發NFκB

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2005.11.007

https://doi.org/10.1038/nri.2017.52

看完瞭PLCγ下遊的蛋白後，再次回到磷酸肌醇信號通路上。PI(4,5)P2既能被PLC水解，也可以被PI3K繼續磷酸化形成PI(3,4,5)P3。這一過程是可逆的，從PIP3到PIP2由一種磷酸水解酶PTEN完成（PTEN因此也是一種重要的抑癌基因）。PIP3可以結合許多激酶，如PDK1，Btk，Vav，PLCγ以及Atk等等。Akt是一種Ser/Thr磷酸激酶，結合PIP3後，被PDK1（同樣與PIP3結合）或mTOR2磷酸化激活，可磷酸化下遊一系列蛋白，促進細胞生存、抑制凋亡。其下遊主要的靶標有GSK3、Foxo1、TSC1/2等，這些蛋白最終會激活mTOR信號通路，改變細胞代謝模式。Btk可以磷酸化Vav，然後Vav進一步招募Nck、Cdc42等蛋白活化WASP，最終使得actin多聚，細胞骨架重構。

T細胞信號傳導

圖片來源：cell signaling technology

和B細胞類似，T細胞的信號傳導通路也是有磷酸激酶一級級傳遞的。TCR的結構如下圖所示：我們在之前章節中已介紹瞭TCR的α和β鏈以及輔助受體CD4/8，但和B細胞一樣，僅TCR是無法傳遞信號的。TCR需要和CD3組成復合物才能正常發揮功能。CD3有ε, γ, δ, ζ四種共六條鏈組成，其中ε, γ, δ主要位於胞外，ζ主要在胞內。CD3所有鏈的胞內部分都含有ITAM（ε, γ, δ每條鏈各一個，ζ各有3個），這使得它們均能被磷酸化激活。TCR和CD3的跨膜區帶有電荷，使得它們存在靜電相互作用。

在T細胞中，首先磷酸化CD3 ITAM的激酶是Lck。Lck的N端有一個SH4結構域，常被脂肪酸化修飾而能夠固定在細胞膜內側，另外在N端也有兩個Cys殘基，通過結合鋅離子和CD4或CD8的胞內尾巴相互作用。Lck平時處於“鎖住”的失活狀態，在C端的酪氨酸殘基(Y505)被磷酸化而被自身SH2結合。Csk是Y505的磷酸化激酶（負調控Lck活性），CD45則負責去磷酸化激活Lck。CD45是幾乎所有白細胞都表達的一類跨膜蛋白，其胞內部分具有磷酸水解酶活性。去磷酸化後的Lck處於半開放狀態，需要其他磷酸激酶或者自己磷酸化Y394而進入激活狀態。

Lck的結構與激活方式。https://doi.org/10.3390/ijms20143500

TCR遇到抗原激活後，Lck將CD3 ITAM磷酸化，隨後磷酸化的ITAM招募ZAP-70激酶。ZAP-70在T細胞的功能和B細胞中的Syk類似，是T細胞激活過程中最重要的激酶之一。ZAP-70有兩個SH2域，平時也處於“自鎖”狀態，隻有結合磷酸化的ITAM後才會露出關鍵酪氨酸殘基被Lck磷酸化。

ZAP-70激活後立刻磷酸化下遊的底物骨架蛋白LAT(linker for activated T cells，跨膜蛋白)和SLP-76（胞質）。LAT, SLP-76，以及一種叫做Gads的蛋白可以在細胞膜內側形成復合物（LAT:Gads:SLP-76 complex），招募多種激酶和信號分子：包括Akt，PLCγ，Vav以及ADAP等等。前三個在B細胞信號通路中已有所涉及，最後一個ADAP的作用是增加T細胞表面黏附蛋白的表達。T細胞表面表達LFA-1，一種由兩條肽鏈構成的黏附蛋白。LFA-1的作用底物為ICAM-1（細胞黏附蛋白-1，也叫CD54），這是一種在血管內皮細胞和多種免疫細胞表面表達的蛋白。非激活條件下，LFA-1處於低粘度構象，無法與ICAM-1結合，隻有當TCR收到刺激後，LFA-1才會聚集成高粘度構象，以便T細胞與血管內皮/樹突細胞等結合。ADAP招募SKAP55和RIAM兩種蛋白，RIAM可激活小G蛋白Rap1（結合GTP），後者作用與LFA-1的胞內結構域使其胞外構象改變成高親和態。與此同時RIAM也會招募Talin1，Kindlin-3等蛋白，最終它們會激活Arp2/3使actin多聚改變細胞骨架形狀。

doi/full/10.1111/j.1365-2567.2011.03549.x

【下半部分將更新免疫共刺激/抑制分子和細胞因子信號通路】

後記：一直很頭疼寫這些信號通路，上Immunology大課的時候這一節也是最催眠的，因為實在過於雜亂沒有任何頭緒，又都是字母信號分子組成的一鍋亂燉，邏輯上不像B細胞、T細胞發育過程那麼一根線順下來。最近的課題涉及到很多關於B細胞發育以及天然免疫受體信號通路的東西，所以希望能夠靜下心來把這一團亂麻理順。anyway大傢湊合著看。