脲酶測定（苯酚鈉-次氯酸鈉比色法）

原理：脲酶存在於大多數細菌、真菌和高等植物裡。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數量、有機物質含量、全氮和速效磷含量呈正相關。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大於堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。脲酶是對尿素轉化起關鍵作用的酶，它的酶促反應產物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用來表示土壤供氮能力。

土壤中脲酶活性的測定是以脲素為基質經酶促反應後測定生成的氨量，也可以通過測定未水解的尿素量來求得。本方法以尿素為基質，根據酶促產物氨與苯酚—次氯酸鈉作用生成藍色的靛酚，來分析脲酶活性。

試劑配制：

1、pH6.7檸檬酸鹽緩沖液：

取368 g檸檬酸溶於600 mL蒸餾水中，另取295 g氫氧化鉀溶於水，再將二種溶液合並，用1 mol/L NaOH（4g氫氧化鈉溶於100ml水）將pH調至6.7，用水定容至2L。

2、10%尿素：

稱取100g尿素，用水溶至1000mL；

3、苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：

A液：62.5g苯酚溶於少量乙醇，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，用乙醇稀釋至100 mL；

B液：27g NaOH溶於100ml水。

A、B溶液保存在冰箱中。使用前將2溶液各100毫升混合，用蒸餾水稀釋至500ml。

4、次氯酸納溶液：

取活性氯≥5.5%的次氯酸鈉溶液81.81ml定容為500 ml 溶液

5、甲苯：(直接購買)

操作步驟:

1、取5g鮮土或10g幹土，置於50mL三角瓶中，加1mL甲苯。15min後加10mL 10%尿素液和20mL pH6.7檸檬酸鹽緩沖液，搖勻後在37℃恒溫箱中培養24 h。

2、過濾後取3mL濾液於50mL容量瓶，然後加水至20mL，再加4mL苯酚鈉溶液，仔細混合，加入3mL次氯酸鈉溶液，充分搖蕩，放置20min，用水稀釋至刻度，一小時之內將著色液在紫外分光光度計上於578nm處進行比色測定。

標準曲線繪制：

氮的標準溶液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶於水並稀釋至1000ml，得到0.1mg/ml的氮標準液，配標曲時稀釋10倍。

吸取氮標準液50mL，定容至500mL，即稀釋10倍，吸取0，1，3，6，9，12，15，18mL移至50 mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚鈉溶液，仔細混合，加入3mL次氯酸鈉溶液，充分搖蕩，放置20min，用水稀釋至刻度。一小時之內將著色液在紫外分光光度計上於578nm處進行比色測定，以標準溶液濃度為橫坐標，以光密度值為縱坐標繪制曲線圖。

結果計算:

脲酶活性以24小時後1g土壤中NH3－N的毫克數表示土壤脲酶活性（Ure）。

NH3－N=（a樣品－a無土－a無基質）×V×n／m

式中：a樣品——為樣品吸光值由標準曲線求得的NH3－N濃度（mg/mL）；

a無土——為無土對照吸光值由標準曲線求得的NH3－N毫克數；

a無基質——為無基質對照吸光值由標準曲線求得的NH3－N毫克數；

V——為顯色液體積（50mL）；

n——為分取倍數，浸出液體積／吸取濾液體積，此處為10；

m——表示烘幹土重

圖片來源於四川華標測實驗室

磷酸酶（磷酸苯二鈉比色法）

原理：測定磷酸酶主要根據酶促生成的有機基團量或無機磷量計算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機基團含量法，是目前較為常用的測定磷酸酶的方法，後一種稱為無機磷含量法。研究證明：磷酸酶有三種最適PH值：4~5、6~7、8~10。因此，測定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶，要提供相應的PH緩沖液才能測出該土壤的磷酸酶最大活性。測定磷酸酶常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液（PH5.0~5.4）、檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）、三羥甲基氨基甲烷緩沖液（PH7.0~8.5）、和硼酸緩沖液（PH9~10）。

試驗配制：

1、Ph5醋酸緩沖液:

A液：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5 mL醋酸，稀釋定容至1000 mL）

B液：0.2mol/L醋酸鈉溶液（32.8g C2H3O2Na 或54.4g C2H3O2Na·3H2O 定容至2000mL），

592 mL A+1408mL B混合即得2000ml緩沖液

2、0.5%磷酸苯二鈉:

10g磷酸苯二鈉溶於2000ml緩沖液

3、 0.3%硫酸鋁:

11.692g 18水合硫酸鋁溶於2L水

4、氯代二溴對苯醌亞胺試劑：取0.30g 2，6-二溴對苯醌亞胺，用24 mL 96%乙醇溶解，貯於棕色瓶中，存放在冰箱裡。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。

5、甲苯：（直接購買）

6、pH9.4硼酸鹽緩沖液：

A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶於1000 mL蒸餾水中

B：0.2 M 硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶於1000 mL蒸餾水中

800mL A+200mLB混合即得1000ml硼酸緩沖液

操作步驟：

1、稱2g鮮土（5g幹土）於200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，輕搖15min後，加入20ml 0.5%磷酸苯二鈉（酸性、中性磷酸酶用PH5醋酸鹽緩沖液配制，堿性用PH9.4硼酸鹽緩沖液配制），仔細搖勻後放入恒溫箱，在37℃下培養24h。

2、到時取出，於培養液中加40ml 0.3%硫酸鋁溶液並過濾。

3、吸取3ml濾液於50ml容量瓶中，然後加入5ml pH9.4硼酸鹽緩沖液，充分搖勻後，加入5滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑，充分搖勻至顯色明顯後定容，30min後比色測定。（用硼酸緩沖液顯色時，呈現藍色，用660nm比色）

標準曲線配制：

酚原液——取1g重蒸酚(苯酚)溶於蒸餾水中，稀釋至1L，貯於棕色瓶中。

酚工作液——取5ml酚原液稀釋至500ml（每毫升含0.01mg酚）。

分別取1、5、9、13、17、21、25ml 酚工作液於50ml容量瓶中，每瓶加入5ml pH9.4硼酸鹽緩沖液 緩沖液，充分搖勻後，再加入5滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑，充分搖勻至顯色明顯後定容，30min後在分光光度計上於660nm 處比色測定。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標（mg）繪成標準曲線。

結果計算：

磷酸酶活性，以24h後1g土壤中釋出的酚的毫克數表示。

酚（mg）=（a樣品- a無基質- a無土）*8

a樣品——吸光值由標準曲線求得的酚毫克數；

a無土——無土對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數；

a無基質——無基質對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數；

8——換算成1g土的系數。

圖片來源於四川華標測實驗室

蔗糖酶測定（3，5-二硝基水楊酸比色法、滴定法）

原理：蔗糖酶與土壤許多因子有相關性，如與土壤有機質、氮、磷含量，微生物數量及土壤呼吸強度有關，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與 3，5-二硝基水楊酸反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。

試劑配制：

1、8%蔗糖溶液:

取86.9565 g蔗糖溶於1L蒸餾水。

2、pH值為5.5的磷酸緩沖液:

9.078 g KH2PO4溶於1L蒸餾水中取950mL，1.1867 g Na2HPO4·2H2O溶於100 mL蒸餾水中取50mL，混合得1000ml磷酸緩沖液。

3、3，5-二硝基水楊酸溶液（DNS試劑）:

稱取2.5 g二硝基水楊酸，溶於100mL 2 mol/L氫氧化鈉（8g氫氧化鈉配制成100m溶液）和250mL水中，緩慢加熱並攪拌至完全溶解(需要較長時間)，再加入150 g酒石酸鉀鈉，攪拌至溶解，用水稀釋至500mL。

（避光保存，不超過一周，最好用無CO2水配制該溶液）

4、甲苯：(直接購買)

操作步驟：

1、稱2 g 鮮土（偏少一點）於50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min後註入15mL 8%蔗糖溶液和5mL pH5.5磷酸緩沖液，搖勻混合物後，放入恒溫箱，在37℃下培養24 h。

2、到時取出，迅速過濾。從中吸取濾液0.5mL，註入50mL 容量瓶中，加3mL 3，5-二硝基水楊酸，並在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3—氨基-5-硝基水楊酸而呈橙紅色，最後用蒸餾水稀釋至50mL，並在分光光度計上於波長508nm處比色。

標曲的配置：

標準葡萄糖溶液：將葡萄糖先在50-58℃條件下幹燥至恒重，然後取2.5g溶於500mL蒸餾水中，即成葡萄糖標準溶液（5mg/mL）（冰箱中4℃保存期約一星期，若該溶液發生混濁和出現絮狀物現象，則應棄之，重新配制）。再取標液25ml稀釋10倍制成250ml葡萄糖工作液（0.5mg/mL）。

繪制標準曲線：取0、2、4、6、8、10、10、14mL葡萄糖工作液，分別註入50mL容量瓶中，加3mL 3，5-二硝基水楊酸，混勻，並在沸騰的水浴鍋中準確反映5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min至室溫。溶液因生成3—氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最後用蒸餾水稀釋至50mL，以空白管調零在波長508nm處比色，以吸光度值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

結果計算：

以24h後1g土壤中葡萄糖的質量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：

Suc=（a樣品－a無土－a無基質）·V· n /m

a樣品、a無土、a無機質——分別表示其由標準曲線求的葡萄糖濃度（mg/mL）；

V——為顯色體積（50mL）；

n——為分取倍數，此為20；

m——為土重（g）。

滴定法

1.試劑配制：

(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）

(2)甲苯(分析純)

(3)PH5.5醋酸鹽－磷酸鹽緩沖液

0.5ml磷酸氫二鈉·12 H2O(1/15M) + 9.5ml 磷酸二氫鉀（1/15M）

磷酸氫二鈉·12H2O(1/15M) ：23.88g Na2HPO4，，加H2O溶解，定容至100ml。

磷酸二氫鉀（1/15M）：9.072g KH2PO4，加H2O溶解，定容至1000ml。

(4)33%KI溶液（4.925g+10ml水）現配，冰箱遮光

(5) H2SO4（1：3）（體積比）：15ml 98% H2SO4 + 45ml蒸餾水

(6)淀粉指示劑

取0.5g淀粉溶於少許水中，加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。 （2.5%NaCl：2.5g NaCl加97.5ml蒸餾水。）

(7)0.1NNaS2O3 滴定液

取25克—–溶解於剛煮沸而冷卻的蒸餾水中，加入少量的碳酸鈉，稀釋至1升。

(8)菲林溶液

取3.464克CuSO4·5H2O溶於蒸餾水，並稀釋至50ml（a），取17.3g酒石酸鉀鈉和5gNaOH溶於蒸餾水，並稀釋至50ml（b），使用前將（a）（b）按1：1混合。

2.操作步驟

取2.5g土置於100ml三角瓶→用0.375ml甲苯處理15min。加2.5ml 20％蔗糖和2.5ml pH5.5醋酸鉛－磷酸鹽緩沖液搖勻後放在37度恒溫箱中培養24h。

培養結束後，加12.5ml蒸餾水。

搖蕩後過濾，取5ml的濾液移入100ml三角瓶中，加2.5ml的菲林溶液，在沸水浴上放置10min，冷卻至室溫後，再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H2SO4（1：3）。加入淀粉指示劑2滴，然後用0.1N NaS2O3 滴定。

顏色：棕色→棕藍色→乳白色（滴定結束）

註意：減量滴定，一般取5ml即可，滴定需Na S2O3 溶液（大量）

空白對照：30.15ml（取5ml時）

3． 結果計算：

蔗糖酶活性（M），用對照與試驗的0.1NNaS2O3滴定量毫升數之差表示。試驗應設以水20毫升代替基質。

M=（A－B）×T×17.875/5/2.5 式中：

A：對照所消耗的0.1NNaS2O3 毫升數

B：濾液所消耗的0.1NNaS2O3毫升數

T：NaS2O3 滴定度的校正值

×17.875/5/2.5：換算成1g 土消耗的0.1NNaS2O3 量

氨基糖、木質素酚、磷脂脂肪酸、微生物量碳氮磷、同位素、微塑料、植矽體等指標均可測定。

檢測項目：土壤/植物/水體/肥料/飼料/農藥殘留/稻米品質/果實品質