撰文︱陳俊茹，王閣，翁史鈞

責編︱王思珍，方以一

焦慮（anxiety）本質上是一種有益的適應性反應，能促使機體對潛在的威脅進行評估，從而保持警覺，提高生存幾率。然而，對外源性或內源性刺激的過度畏懼、不安及表現出回避行為，則構成焦慮癥（anxiety disorder），是當今患病率最高的精神障礙，影響全球人口的7.3%[1]。越來越多的證據表明，焦慮水平受到光的調制：光照條件（如強度、時程、波長等）的慢性、長期改變，會顯著影響人類及實驗動物的焦慮水平；此外，少量工作還表明，急性的強光處理亦促使動物出現焦慮樣行為，但其機制尚不明晰。視網膜是光信號神經處理的起點，被認為在光對焦慮水平的調制中具有重要作用。近年來，楊雄裡院士團隊圍繞一種特殊的視網膜神經元——自感光視網膜神經節細胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cell, ipRGC）展開瞭深入研究，取得瞭一系列成果（Liu et al., Sci Adv, 2022; Chen et al., Diabetes, 2021; Zhou et al., J Neurosci, 2021）。ipRGC表達一種特有的視色素——視黑質（melanopsin），是在視網膜上發現的第三類感光細胞，能不依賴視桿和視錐而直接對光產生反應[2, 3]，其軸突投射至多個腦區，介導非成像視覺功能，如晝夜節律和瞳孔對光反射等[4, 5]。最近，國內外研究小組的工作相繼顯示，ipRGC通過直接或間接地向多個中樞腦區提供光信號輸入，參與光對各種復雜高級功能，如睡眠[6]、學習記憶[7, 8]和情緒[9, 10]的調節。值得註意的是，關於短時程的強光暴露是否足以誘發持續性的、且在光刺激撤除後依然存在的焦慮樣行為，及ipRGC是否及如何參與上述光促焦慮效應，目前尚無定論。

2023年3月22日，復旦大學腦科學研究院楊雄裡院士團隊在《科學·進展》（Science Advances）上發表瞭題為“Short-term Acute Bright Light Exposure Induces a Prolonged Anxiogenic Effect in Mice via a Retinal ipRGC-CeA Circuit”的研究論文。此項工作闡明瞭ipRGC向中央杏仁核（CeA）的投射在急性明亮光照誘發的小鼠持續性焦慮樣行為中的作用，且揭示瞭焦慮癥幹預的新型潛在靶點。博士研究生王閣為論文第一作者，楊雄裡院士、翁史鈞研究員為論文共同通訊作者。（拓展閱讀：楊雄裡院士團隊組相關研究進展，詳見“邏輯神經科學”報道（點擊閱讀）：Sci Adv︱楊雄裡院士團隊揭示自感光視網膜神經節細胞在近視形成中的重要作用）

關於光照對情緒功能影響的工作，大多僅涉及長期光照變化（例如循環光照模式的異常及光剝奪等）所導致的慢性作用[7, 11]；相反，對於短時光照變化引起的急性影響及其作用機制，目前所知不多。作者在C57BL/6小鼠晝夜節律中的活動相（CT14-17）施加25分鐘的急性白光照射後，使之回歸黑暗環境，隨即進行行為學測試，檢測其情緒功能的變化（圖1 A-C）。曠場實驗（OFT）和高架十字迷宮（EPM）的結果顯示，急性光照導致瞭光強依賴性的促焦慮效應；當光強為1000 lux時，小鼠進入中央區（OFT）和開放臂（EPM）的時間及次數均顯著減少，但並未引起運動抑制。作者繼而在1000 lux的25分鐘光照中止後的不同時間點進行OFT和EPM測試，研究瞭上述光促焦慮效應的持續性。與黑暗組相比，光暴露組在光照撤去20 min後，依然呈現更為強烈的焦慮樣行為（圖1 D, E）。出乎意料的是，在EPM中，即使在光照中止1小時後，光暴露組進入開放臂的次數仍然顯著低於黑暗組（圖1 E）；光照中止2小時後，兩組的所有焦慮相關行為學參數均具接近（圖1 D, E），表明此時促焦慮效應已經消失。

圖1 短時程的急性明亮光照在C57BL/6小鼠誘發持續性焦慮樣行為（圖源：G. Wang,et al., Science Advances, 2023）

光照對腦高級中樞的影響，依賴於視網膜感光細胞的光電轉換功能。視網膜存在兩條感光途徑，一條依靠視桿和視錐這兩類常規光感受器，另一條則由ipRGC通過其所含的視黑質直接感光。為探索前述的強光暴露所致的持續性焦慮樣行為是由哪條視網膜感光途徑介導的，作者通過多種遺傳學小鼠，結合藥理學操作進行瞭研究。在腹腔註射MNU從而引起視桿和視錐大量凋亡的C57BL/6小鼠(圖2 A-G)，OFT和EPM結果顯示光促焦慮效應依然存在(圖2 H, I)，且該結果在視桿、視錐均幾乎完全退變消失的rd/rd cl突變小鼠上得到瞭重復(圖2 J, K)。上述結果提示，基於視桿-視錐系統的視網膜常規感光通路，對急性強光暴露導致的小鼠持續性焦慮樣行為的貢獻微弱。

圖2 明亮光照所致的持續性促焦慮效應不依賴於視桿/視錐信號（圖源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）

另一方面，在視黑質被選擇性敲除的Opn4–/–小鼠中，未觀察到前述的強光誘發焦慮樣行為的效應（圖3 A-C)，這提示該效應具有視黑質依賴性，也暗示具有視黑質感光通路的ipRGC可能是為該效應提供光信號的視網膜感光神經元。為檢驗這一推斷，作者使用一種特異性損毀ipRGC的免疫毒素melanopsin-saporin（SAP），對C57BL/6小鼠進行雙眼眼內註射後，再進行行為學實驗，並以註射PBS（SAP溶劑）的動物作為對照。OFT和EPM實驗表明，當絕大部分ipRGC被損毀後，1000 lux明亮光照誘發的焦慮樣行為消失，這與Opn4–/–小鼠的結果類似（圖3 D-F)。上述這些結果綜合提示，視黑質驅動的ipRGC對明亮光照信號的編碼，在前述的光促焦慮效應中具有關鍵的作用。

圖3 視黑質敲除和ipRGC損毀均消除瞭強光誘發的持續性焦慮樣行為（圖源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）

接下來，作者對短時明亮光照誘發小鼠持續性焦慮樣行為的中樞機制展開瞭探索。首先，對已知的和焦慮相關的多個腦區，在25分鐘1000 lux光照後，進行瞭c-fos表達水平的定量檢測，初步篩選出瞭數個潛在的參與光促焦慮效應的腦區（圖4 A,B）。在這些腦區中，CeA尤為引人註意——既往的順行示蹤研究顯示，該腦區受到少量ipRGC軸突的支配[12]。接著，作者在ipRGC被紅色熒光特異標記的Opn4Cre/+; Ai14小鼠的CeA，進行瞭示蹤劑CTB-488的立體定位註射；結果表明，視網膜上被逆行標記的神經節細胞數目盡管不多，但大部分（近80%）為ipRGC，從而確認瞭存在ipRGC至CeA的直接投射（圖4 C,D）。繼而，借助病毒轉染進行的化學遺傳學操縱實驗表明：在CeA註射AAV-hSyn-hM4Di-EGFP並以CNO處理小鼠，從而壓抑C57小鼠CeA的活動，可阻斷前述的光促焦慮效應（圖4 E-H）；此外，在Opn4Cre/+小鼠CeA註射Cre依賴性的逆行病毒AAV-retro-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry，CNO處理後能選擇性激活投射至CeA的ipRGC，而這一操作顯著提升瞭黑暗中小鼠的焦慮水平（圖4 I-L）。這些結果充分表明，ipRGC–CeA的直接投射環路在強光誘發的持續性焦慮樣行為中扮演瞭重要角色。

圖4 ipRGC-CeA投射參與明亮光照誘發的持續性促焦慮效應（圖源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）

在本工作的最後，作者初步研究瞭皮質酮（CORT）這一與內態平衡和應激狀態相關的重要激素[13]在光促焦慮效應中的作用。酶聯免疫吸附分析（ELISA）結果顯示，在25分鐘1000 lux光照後，小鼠血清和腦脊液的皮質酮水平均無顯著變化（圖5 A, B）。然而，對不同腦區樣本的定量免疫印跡分析顯示，CeA和終紋床核（BNST）的糖皮質激素受體（GR）及其磷酸化形式（p-GR）的蛋白表達水平均顯著升高（圖5 C-E）。此外，皮下註射GR特異性拮抗劑RU486後，小鼠在OFT和EPM中進入中央區/開放臂的次數及停留時間均不再因光照而減少（圖5 F, G），即RU486完全消除瞭強光誘發的促焦慮效應，強烈提示該效應的產生與皮質酮系統活動的提升有關。

圖5 阻斷糖皮質激素的作用消除強光誘發的持續性焦慮樣行為（圖源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）

圖6 工作總結圖：短時強光暴露通過ipRGC–CeA環路引起小鼠持續性焦慮樣行為（圖源：https://iobs.fudan.edu.cn/6c/e3/c17248a486627/page.htm）

文章結論與討論，啟發與展望

該研究應用多學科技術，研究瞭強光在焦慮水平調制中的作用及其視網膜、中樞機制（圖6）。實驗表明：急性施加的短時明亮光照使小鼠產生持續性的焦慮樣行為，而這一效應對光信號的檢測，是由視黑質光轉導所驅動的ipRGC的興奮介導的。對其中樞機制的初步探索顯示，ipRGC–CeA的直接投射環路在上述的持續性焦慮樣行為中起瞭關鍵作用。進一步工作則揭示皮質酮系統活動水平的提高在其中也扮演瞭重要角色。

然而，該論文尚留下瞭一些未能解答的問題。例如，目前尚不能確定究竟是哪一種或幾種亞型的ipRGC在這一促焦慮效應中發揮作用。因為M1型ipRGC中視黑質含量最高，也因而最易被SAP損毀，且已被證明投射至多個與情緒調控相關的腦區，作者猜測該亞型很可能提供瞭強光促焦慮效應的主要視網膜驅動源。在未來工作中，使用特定亞型ipRGC損毀或激活的遺傳學小鼠[14]開展實驗，將為最終解決這一問題提供有力線索。又如，除CeA外，尚有SCN、BNST、vLGN等其它接受ipRGC投射的腦區，在焦慮情緒調制中起一定作用[15-18]，且這些腦區與CeA間還可能存在復雜的相互作用；這些腦區是否及如何參與該工作觀察到的光促焦慮效應，也有待在今後的研究中，通過設計更為精巧的實驗加以檢驗。

綜上所述，這項工作系統地闡明瞭由一類特定視網膜神經元起始的視覺神經環路在焦慮水平調制中的重要作用，為研究病理性焦慮的機制和幹預策略提供瞭新思路，並可能為一系列視覺相關的神經精神疾病的診療提供瞭一個潛在的新靶點。

原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf4651

第一作者王閣（前排左四），通訊作者楊雄裡（前排左五），通訊作者翁史鈞（前排右一）（照片提供自：楊雄裡實驗室）

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