酪氨酸酶（Tyrosinase）是一種廣泛分佈於不同生物體中的含有多個銅離子的生物酶，在黑色素的生成和酶促褐變過程中發揮著重要作用。因此，其抑制劑可以作為美白劑在化妝品和醫藥行業中具有廣泛應用，也可以作為抗褐變化合物應用在食品和農產品中。為此，科學傢已經通過不同的篩選方法開發出瞭許多天然的、半合成的和合成的的抑制劑。這篇綜述集中介紹瞭過去40年裡從所有來源發現的具有生物化學活性的酪氨酸酶抑制劑。
水果、真菌和蔬菜的褐變與人類皮膚的色素沉著是兩種常見的不良現象。研究發現：酪氨酸酶是褐變和哺乳動物中黑色素生成的主要酶。這使得研究人員和科學傢更加專註於新的強效酪氨酸酶抑制劑的鑒定、分離、合成和表征，用於食品、化妝品和醫藥工業。然而，很少有酪氨酸酶抑制劑能夠適合臨床使用和皮膚美白。隨著對酪氨酸酶抑制劑的臨床和工業需求的增加，相關的體外分析和抑制劑篩選技術也在快速發展，為酪氨酸酶抑制劑和皮膚增白劑的體外高通量篩選提供支撐。換句話說，敏感和正確的分析方法對於篩選和開發有效的酪氨酸酶抑制劑具有重要的意義。為到目前為止，研究人員已經應用和開發瞭幾種分光光度法、色譜法、電泳法、放射法和電化學測定方法。最近，一種新型的熒光生物傳感器和基於酪氨酸酶的薄層色譜自顯譜被應用於酪氨酸酶抑制劑的篩選。
此外，在體外檢測方法進步的基礎上，通過使用虛擬篩選和構建抑制劑的定量構效關系（QSAR）模型，可以進一步提高酪氨酸酶抑制劑篩選的成功率。因此，結合生物信息學模擬和體外分析將有助於瞭解被篩選化合物的功能機制。最近，Gao[1]等人對中藥（TCM）進行瞭虛擬篩選，並通過3D- QSAR藥效團模型預測瞭其對酪氨酸酶的抑制活性。Khan[2]在2012年發表瞭一篇綜述，總結瞭基於計算機輔助藥物設計手段，如基於QSAR和基於配體的虛擬篩選技術開發出來的酪氨酸酶新型抑制劑。由於酪氨酸酶抑制劑如此重要，其它的科學傢也報道瞭另外的一些綜述，介紹瞭許多來自於天然產物或半合成/全合成來源的酪氨酸酶抑制劑。在上述工作的基礎上，本文綜述瞭從所有來源發現的酪氨酸酶抑制劑，包括合成化合物、天然產物提取物中的活性成分、近四十年發表的虛擬篩選和基於結構的分子對接研究發現的抑制劑。我們希望本綜述中提供的知識可以作為一個更新的全面數據庫，有助於開發新的安全高效的抗酪氨酸酶藥物，用於預防植物性食品、海鮮的褐變和人類色素沉著治療。
一、酪氨酸酶在黑色素生物合成中的作用
黑色素是人類皮膚、頭發和眼睛色素沉著的主要色素，由黑色素細胞產生。黑色素生成和皮膚色素沉著是人體對抗太陽紫外線輻射損傷和皮膚光致癌的最重要的光保護因素。因此，黑色素的異常喪失和脫色是人類的一個嚴重的面部美學和皮膚問題。同時，這些色素的過度合成和累積也會發生在許多皮膚疾病中，包括黑棘皮病、宮頸變厚皮病、黃褐斑、眼眶周圍色素沉著、雀斑、與帕金森病相關的神經退行性病變以及皮膚癌癥風險等。
黑色素的生成是一個復雜的過程，涉及瞭大量的酶和各種化學反應，其中酪氨酸酶和酪氨酸酶相關蛋白(TYRP1 and TYRP2)在黑色素的合成中起著關鍵作用。酪氨酸酶是一種含有雙核銅離子的多功能含銅金屬酶，在黑色素的合成過程中起著限速酶的作用。
圖1 真黑色素和嗜黑色素的生物合成通路
酪氨酸酶是導致水果和蔬菜出現褐變以及由黑色素過量產生而導致的疾病的主要原因。因此，通過酪氨酸酶抑制劑控制酶的活性是治療哺乳動物色素減退紊亂和水果和菌類褐變的必要手段。迄今為止，科學傢已經開發出來瞭許多有效的抑制劑，用於醫療和化妝品產品，以及食品生物加工、農業工業和環境工業。但能夠作為抗黑色素瘤藥物用於臨床的安全有效的酪氨酸酶抑制劑還不多見。
來自於植物、動物和微生物中的酪氨酸酶均已被分離和純化，雖然它們中的許多（如人類）已經被測序，但隻有少數的結構已經被解析。在不同來源的酪氨酸酶中，來自雙孢蘑菇的蘑菇酪氨酸酶是酪氨酸酶的主要的和廉價的來源，與人類酪氨酸酶相比具有較高的相似性和同源性。由於這些良好的特性，蘑菇酪氨酸酶的結構、功能和生化特性已被廣泛研究，作為酪氨酸酶抑制劑篩選和黑色素生成研究、酶催化反應和酶抑制劑結構研究的模型系統。雙孢蘑菇酪氨酸酶是一種120 kDa的四聚體，具有兩個不同的亞基。它有3個結構域和2個銅離子結合位點，它們與6個組氨酸殘基結合，並與酪氨酸酶活性位點上的分子氧相互作用。此外，還有一個二硫鍵穩定瞭該結構。
二、酪氨酸酶抑制機制
由於酪氨酸酶在黑色素的生成和褐變過程中起到關鍵作用，迄今為止，許多從天然（真菌、細菌、植物）和合成來源中發現的酪氨酸酶抑制劑已被報道。一般來說，酪氨酸酶抑制劑是在單酚類底物如酪氨酸或雙酚類底物如L-多巴存在的情況下進行檢測的，並根據多巴色素(Dopachrome)的合成來評估酶的活性。
在不同類型的化合物中，如特異性酪氨酸酶失活劑和抑制劑、o-多巴喹酮清除劑、替代性酶底物、非特異性酶失活劑和變性劑，隻有特異性酪氨酸酶失活劑和可逆抑制劑實際上作為真正的抑制劑與酶結合，並真正抑制其活性。特異性酪氨酸酶失活劑，又被稱為自殺失活劑或基於機制的抑制劑。
圖2 酪氨酸酶對鄰二酚作用過程中自殺性失活的結構機制
酪氨酸酶的自殺失活，可能存在兩種機制。Haghbee等人認為，在酪氨酸酶的三級和四級結構中，由底物和溶劑分子介導所引發的構象變化可能是自殺失活的真正原因。然而，另一方面，根據報道，我們發現N-乙酰咪唑對酪氨酸殘基的乙酰化可以保護蘑菇酪氨酸酶免受在其兒茶酚底物存在下的自殺失活而對酶的二級結構沒有任何重大影響。
不同底物（如O-二酚類底物，抗壞血酸，L-和D-多巴，以及與不同的氨基酚和鄰二胺）的酪氨酸酶自殺性失活過程的動力學已經被研究。作者已經證實，在將一個質子轉移到氧-酪氨酸酶活性位點上的過氧化物基團後，可能會發生自殺失活，也有人提出，單酚不會使酶失活。鄰二酚、抗壞血酸、氨基酚和鄰二胺、羥基對苯二酚、四氫生物蝶呤、四氫葉酸111和NADH，這些底物的化學結構是多種多樣的，但它們參與酪氨酸酶失活的過程都需要上述的氧化/還原步驟。
一般來說，“真正的抑制劑”的抑制模式是這四種類型之一：競爭性、非競爭性、混合類型（競爭性/非競爭性）和無競爭性。競爭性抑制劑可以與遊離酶結合，並阻止底物與酶活性位點結合。
鑒於酪氨酸酶是一種金屬酶，銅螯合劑(如許多芳香族酸、酚類和多酚類化合物，少數非芳香族化合物)可以通過模仿酪氨酸酶的底物來競爭性地抑制酪氨酸酶。最近，有研究發現D-酪氨酸通過抑制酪氨酸酶的活性，競爭性地負調控黑色素的合成。此外，L-酪氨酸也已被證明是一種酪氨酸酶抑制劑。
相比之下，非競爭性抑制劑隻能與酶-底物復合物結合，而混合（競爭性和非競爭性混合）抑制劑可以與自由酶或酶-底物復合物結合。而無競爭性抑制劑則與具有相同平衡常數的遊離酶和酶-底物復合物結合。非競爭性抑制和混合抑制是在蘑菇酪氨酸酶活性的動力學研究中觀察到的常見模式。鄰苯二甲酸和肉桂酸羥基吡啶酮衍生物是單酚類酶活性的混合型抑制劑的兩個例子。此外，一些化合物，如鄰苯二甲酸和對苯二甲酸，D-（-）-阿拉伯糖，巴西蛋白，百裡酚類似物都被證明是二酚酶活性的混合型效應例子。此外，其他化合物如雙吡啶衍生物，二噻二唑衍生物、巴巴林，氯辛酸，丙酸，一些N-（單羥基或二羥基芐基）-N-亞硝基羥胺和對烷基苯甲醛則無競爭性地抑制蘑菇酪氨酸酶的兒茶酚酶活性。噻唑的一些衍生物是非競爭性酪氨酸酶抑制的例子。
除瞭確定抑制機制外，還應在酶動力學研究、抑制劑研究和抑制劑篩選中計算以抑制劑濃度表示的抑制強度，以比較抑制劑與其他抑制劑的抑制強度。然而，由於不同的檢測條件（不同的底物濃度、孵育時間和不同來源的酪氨酸酶），半抑制濃度值可能是不可比較的，但可以用陽性對照加以替代。雖然，一些研究人員沒有計算半抑制濃度，但幸運的是，在大多數研究進行新的酪氨酸酶抑制劑篩選時，他們都會用流行的美白劑：如曲酸、熊果酸或對苯二酚，作為陽性對照物。然而，在不同類型的蘑菇酪氨酸酶抑制劑中，一些抑制劑(如對苯二酚、熊果苷、菊酸、壬二酸、L-抗壞血酸、鞣花酸和氨甲環酸等在化妝品行業中作為美白劑)，盡管它們是安全的，卻很少有文獻報道能夠證實它們作為皮膚增白劑的作用。
最近，Mann[3]等人比較瞭對苯二酚、熊果苷和曲酸對人酪氨酸酶和蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。他們發現對苯二酚和熊果苷和曲酸（IC50> 500 μmol/L）能夠微弱的抑制人酪氨酸酶。相比之下，間苯二酚-噻唑衍生物硫胺醇是一種最有效的人酪氨酸酶抑制劑（IC50=1.1 μmol/L），但對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用較弱（IC50=108 mmol/L）。此外，脫氧熊果苷，作為一種新型的可逆性酪氨酸酶抑制劑，具有強效的皮膚美白效力，這是因為它具有良好的皮膚滲透能力，並對人酪氨酸酶有很強的結合親和力[4]。在另一項研究中，杉本等人研究瞭α-熊果苷和熊果苷與人酪氨酸酶的抑制作用的比較，他們發現α-熊果苷強於熊果苷[5]
三、天然來源的酪氨酸酶抑制劑
從植物、細菌和真菌的代謝物中分離得到的天然來源的抗酪氨酸酶活性物質越來越受到關註。許多研究人員更傾向於從天然來源中尋找抑制劑，因為它們的毒性較小並有更好的生物利用度，特別適用於食品、化妝品和藥物領域的應用。眾所周知，酚類化合物是從植物中提取得到的植物素中最主要的成分，也是植物素之所以有生物活性的主要原因。許多植物提取物具有酪氨酸酶抑制活性，因此成為瞭尋找新型抗酪氨酸酶化合物的重要源泉。例如，以下植物的抗酪氨酸酶活性已被各種研究者報道：小黃曲黴、黑桑、熊果、阿魏菇、由鼠李糖乳桿菌、副幹酪乳桿菌發酵的藿香、黃花蒿、決明子、紅景天、良薑、花椒和花椒花粉、杧果、羅漢松、苦瓜、檸檬香茅、球花紅鵑、葡萄葉、歐亞旋覆花等。此外，Chiari等人還對來自阿根廷中部的91株本地植物進行瞭酪氨酸酶抑制活性研究。他們的研究結果證實上述植物的提取物都具有酪氨酸酶抑制劑作用。其中：松葉金絲桃、鐵皮石斛、千葉蘭顯示瞭最強的抑酶活性。(IC50=280~290μmol/mL)
四、微生物來源的酪氨酸酶抑制劑
來自不同屬的真菌，如曲黴菌、木黴菌、擬青黴菌、裂蹄木層孔菌、 白肉迷孔菌、竹蓀、液體培養的潔麗香菇都被報道其代謝產生的生物活性化合物作為新型酪氨酸酶抑制劑的來源。此外，也有一些報道稱，酪氨酸酶抑制劑從一些海洋真菌物種、藻類和褐藻中分離得到。此外，也有一些關於細菌種類及其代謝物抑制酪氨酸酶的報道。
其中，從土壤中分離到的某些細菌也是酪氨酸抑制劑的潛在來源。此外，一些從革蘭氏陰性的海洋細菌及有毒的藍藻菌株分離得到的酪氨酸酶抑制劑也已被報道。。有趣的是，一些益生菌，如用於發酵的乳酸菌屬也已被研究作為天然酪氨酸酶抑制劑來源。根據研究，已證實發酵提取物的生理活性明顯高於未發酵提取物，其細胞毒活性明顯低於未發酵提取物。近年來，Ji等人證實瞭從奶牛糞便中分離出的四種不同的乳酸菌（LAB）。最後，在費爾南德斯對已報道的發現進行的最新綜述中，總結瞭微生物產生的酪氨酸酶抑制劑。其綜述表明，從植物來源和真菌中分離出的各種酪氨酸酶抑制劑主要是酚類化合物、類固醇和生物堿。相比之下，來自細菌的酪氨酸酶抑制劑則以生物堿、大環內酯和多酚組成，它們都能競爭性地抑制酶[6]。
五、來自天然、半合成和合成來源的抑制劑
5.1 單酚類
以具有至少一個芳香環和一個（或多個）羥基為特征的酚類化合物可以根據其碳原子的數量和排列進行分類。這些化合物通常會與糖和有機酸結合。由於其分子量和芳香環的數量，酚類物質包括從簡單的單寧到復雜的衍生多酚。簡單酚類如對苯二酚及其衍生物、脫氧熊果苷及其衍生物、4-(6-羥基-2-萘）-1,3-苯二酚、間苯二酚（或間苯二素）和4-正丁基間苯二酚、香蘭素及其衍生物已被科學文獻報道為酪氨酸酶的酚類抑制劑（圖3）。
圖3 部分單酚類化合物的結構式
科學傢研究發現，從野漆樹的汁液中分離出的烷基對苯二酚：(Z)-10-庚烯基對苯二酚也具有酪氨酸酶抑制作用並能抑制黑色素在動物細胞中的生成。該化合物的半數抑制濃度（IC50=37 μM）小於典型的酪氨酸酶抑制劑對苯二酚（IC50=70 μM）。研究者認為，該衍生物對酪氨酸酶活性的有效抑制作用可能是由於其庚烯烯鏈的存在促進瞭對苯二酚環的氧化。異它喬糖甙（甲氧基-對苯二酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）是一種從東亞直蒴苔和夾竹桃葉海神花中分離出來的活性化合物。它及其糖苷衍生物（糖苷、木糖苷、纖維生物苷和麥芽糖苷）被歸類為熊果苷的類似物。然而，異它喬糖甙和熊果苷不是強效的酪氨酸酶抑制劑。但它們的葡萄糖苷、木糖苷、纖維生物苷、麥芽糖苷衍生物和苯甲酰衍生物作為酪氨酸酶抑制劑，IC50分別為417、852、623和657 μM。在這些新型抑制劑中，葡萄糖苷衍生物最為有效（IC50=417 μM），表明間苯二酚和葡萄糖的結構組合具有顯著的誘導抑制作用。
對苯二酚及其一些已知的衍生物，包括α和β-熊果苷，被認為是酪氨酸酶的抑制劑和底物。脫氧熊果苷及其第二代衍生物由於其有效抑制劑量的毒性較小，被認為是很有前途的改善色素沉著病變或皮膚增白的藥物。
5.2 多酚類
植物能產生各種各樣的多酚，包括酚酸類、黃酮類、芪類和木質素類。大量研究報道瞭這些化合物或強或弱的抑酶活性。
5.2.1 黃酮類
在多酚類化合物中，一些主要存在於草藥、水果中或來源於合成途徑的黃酮衍生物被認為是酪氨酸酶的有效抑制劑。黃酮類化合物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用與黑色素細胞中的黑色素合成顯著相關。在從天然產物中尋找有效的酪氨酸酶抑制劑時，已分離出許多類黃酮化合物，並評價瞭其對不同天然來源的物質對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性。例如：三葉草、綠豆、金橘果皮、滇桑、巴西野牡丹、富裡艾馬桉樹莖提取物、平菇、雞冠草、良薑、桑葚根、金錢樹、面包果樹等各類植物和其它許多中草藥中都提取分離得到瞭具有一定活性的酪氨酸酶抑制劑。
圖4 常見的黃酮類結構
最常見的黃酮是木犀草素、芹菜素、黃芩素及其苷（如芹菜草素、芹菜素和黃芩苷）。此外，川陳皮素和橙皮黃素是多甲氧基黃酮。Nguyen等人研究瞭青蒿心材甲醇提取物和芹菜素以及其他11種酚類化合物對酪氨酸酶的抑制活性。在另一項研究中，科學傢發現瞭黃酮衍生物，即7,8,4’-三羥基黃酮，可抑制酪氨酸酶活性，其IC50=10.31 ± 0.41μM，Ki=9.50 ± 0.40 μM。該化合物對酪氨酸酶的猝滅作用是靜態的，隻有一個結合位點，結合常數為7.50±1.20M-1。根據熱力學參數，結合過程涉及氫鍵和范德華力。此外，對接模擬還顯示瞭該化合物與活性位點245的殘基His244和Met280之間的氫鍵作用。
5.2.2 萜類衍生物
香芹醛是一種單萜類苯酚。迄今為止，一些合成來源的香芹醛衍生物、補骨脂、從山茱萸中分離得到的萜烯酚都被證明具有抗酪氨酸酶活性。
5.2.3 醌類衍生物
醌類是一類小分子，主要來自於芳香族化合物，如苯或萘。在這些化合物中，蘆薈的蒽醌C-糖苷、虎杖的蒽醌和丹參酮IIA（IC50=214 μM）已被證實為酪氨酸酶抑制劑。
5.2.4 苯衍生物
幾個聯苯衍生物（圖5），如4,4-二羥聯苯聯苯、聯苯酯衍生物、羥聯苯取代聯苯烷酮、羥基聯苯、功能化雙聯苯取代噻唑烷酮、苯甲酸衍生物、苯乙酰胺和苯甲酰胺衍生物等均已被確定為酪氨酸酶抑制劑。
圖5 一些苯衍生物的結構與抑制活性
5.2.5 唑類和噻唑烷類衍生物
到目前為止，科學傢已經研究瞭幾種唑類衍生物（圖6）的酪氨酸酶抑制活性。發現的新型抑制劑包括DL-3-（5-苯並唑基）丙氨酸和甲基多巴類似物，芳基吡唑，基於吡唑和噻唑烷酮骨架的衍生物、異惡唑酮衍生物、咪唑離子液體、噻唑基間苯二酚等。此外，一些噻唑烷衍生物的酪氨酸酶抑制活性已被評價，包括噻唑烷酮取代的噻唑烷酮、(Z)-5-（2,4-二羥基芐基苯甲烷）噻唑烷-2-4-二酮、5-（取代芐基二烷）噻唑烷-2,4-4-二酮衍生物等。
圖6 唑類和噻唑烷類衍生物的結構與抑酶活性
5.2.6 曲酸類似物
曲酸是一種著名的酪氨酸酶抑制劑。當DL-多巴、去甲腎上腺素和多巴胺被酪氨酸酶氧化時，曲酸能有效抑制有色產物的生成和氧的重攝取。此外，它的一些衍生物已經顯示出強大的酪氨酸酶抑制活性。Noh等用氨基酸對曲酸進行修飾，並篩選其酪氨酸酶抑制活性。其中，曲酸-苯丙氨酸酰胺表現出較強的非競爭性抑制作用。有趣的是，一些曲酸衍生物盡管具有脫色活性，但並沒有顯示出酪氨酸酶抑制活性最近，科學傢報道瞭一種焦酸類似物5-苯基-3-[5-羥基-4-吡咯-2-基l-甲硫基]-4-（2,4-二羥基芐基胺）-1,2,4-三唑，作為一種有效的競爭性酪氨酸酶抑制劑，半抑制濃度值為1.35 ± 2.15 μM。部分曲酸衍生物的酪氨酸酶抑制活性如圖7所示。
圖7 曲酸衍生物的結構及抑酶活性數據
5.2.7 苯甲醛衍生物
科學傢對苯甲醛及其衍生物、羥基或甲氧基取代苯醛肟和苯甲醛-o-烷基肟、哌酮或4-（亞甲基二氧）苯甲醛介離子衍生物、4-羥基苯甲醛衍生物、茴香醛的酪氨酸酶的抑制活性進行瞭研究。
在這些衍生物中，3,4-二羥基苯甲醛-氧肟（IC50=0.3±0.1μM）與已知最好的酪氨酸酶抑制劑托酚酮（IC50=0.13±0.08 μM）的大小相同。在苯甲醛衍生物中，醛基和末端甲氧基的存在對其抑制作用起著重要作用。但不幸的是，由於其較低的活性水平或嚴重的副作用，絕大多數4-取代苯甲醛衍生物不能考慮實際使用。
5.2.8 羧酸衍生物
科學傢研究瞭丙酮酸、丙烯酸、丙酸、2-氧-丁酸和2-氧-辛酸等羧酸衍生物對酪氨酸酶活性的抑制作用。研究結果顯示，脂肪族羧酸對蘑菇酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶活性具有雙重影響。他們發現，在正烷基酸（丙酮酸、丙烯酸、丙酸、2-氧-丁酸）的存在下，酪氨酸酶的二酚化酶活性不受抑制，而單酚化酶的活性則被所有類型的正烷基酸所抑制。他們認為，單二酚和鄰二酚與酪氨酸酶活性位點的對接存在物理差異。另一方面，酸通過它們的羧酸基與雙核位點上的一個銅離子發生結合。因此，這些羧酸化合物通過阻止單酚與酶的氧型結合，完全阻止瞭單酚酶的反應。
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