RAW264.7細胞系的應用：

RAW264.7是單核細胞/巨噬細胞樣細胞系，源自BALB/c 微小核糖核酸的Abelson白血病病毒轉化細胞系。RAW264.7是破骨細胞、炎癥研究最常用的體外模型之一。

破骨細胞生成研究：RAW264.7已被證明在RANKL誘導下容易分化為破骨細胞。與原發性破骨細胞前體不同，RAW264.7的分化無需添加巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）。

炎癥研究: RAW264.7是篩選抗炎活性物和研究炎癥最常用的體外研究模型。在誘導劑（如脂多糖LPS）的作用下，RAW264.7細胞會模擬炎癥反應，釋放或上調多種炎癥介質如一氧化氮（NO）、環氧合酶-2（COX-2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等。

CRISPR/Cas9介導的miRNA-155敲除模型，幫助探究類風濕關節炎中可抑制RAW264.7細胞產生促炎細胞因子

據報道，類風濕關節炎(RA)影響著全世界2100多萬人。RA是一種影響關節的自身免疫性炎癥疾病。它的特征是巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，滑膜成纖維細胞增殖，最終的關節破壞。巨噬細胞在RA發病機制中發揮重要作用。RA炎性滑膜中巨噬細胞數量高於正常關節，與關節疼痛和炎癥的嚴重程度呈正相關。許多藥物已經被批準用於治療風濕性關節炎，基因或細胞療法。

MicroRNA 155 (miR-155)在小鼠16號染色體和人類21號染色體的BIC基因中被發現。在臨床和實驗模型中，miR-155與RA的發病機制有關，因為它在RA患者的滑膜和滑膜液巨噬細胞中上調。siRNA敲低miR-155 (KD)可以抑制促炎細胞因子的產生。miR-155參與RA形成的機制可能是多方面的，其中之一是miR-155靶向Src同源性-2的3個未翻譯區域，其中包含肌醇磷脂酶1 (SHIP1)，炎癥的負調節因子。因此，RA中升高的miR-155導致SHIP1水平降低，導致促炎細胞因子的產生升高。

研究者利用CRISPR/CAS9技術成功突變小鼠巨噬細胞RAW264.7內源性miR-155基因，獲得miR-155基因組敲除(GKO)克隆。進一步分析表明，在LPS刺激下，miR-155 GKO克隆表達更高水平的SHIP1，但產生較少的促炎細胞因子。

通過使用miR-155 GKO克隆，去除miR-155會導致巨噬細胞產生促炎細胞因子的減少，從而證實瞭之前的觀察，即升高的miR-155有助於RA患者細胞因子產生的持續水平。通過將miR-155模擬物轉染回GKO克隆，研究者能夠重新引入miR-155效應。總之，這些結果表明，內源性miR-155基因的突變可能導致pre-miR-155產物被截斷，無法成熟為更短但穩定的miR-155。

通過CRISPR/Cas9技術將GFP敲入Raw264.7細胞，靶向NLRP3炎性小體，探究改善炎性疾病新靶點

NLR傢族蛋白NLRP3是外源性病原體和內源性損傷相關分子模式(DAMPs)的胞質傳感器。NLRP3激活後，與適配器蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase-1組裝，形成NLRP3炎性小體，導致caspase-1的裂解和激活。活化的capase-1裂解IL-1的細胞因子和IL-18的前體，使其成熟，並導致幾種促炎細胞因子的釋放，包括IL-1的細胞因子和IL-183。據報道，NLRP3炎癥小體在多種炎癥疾病的發生和發展中起重要作用。抑制NLRP3炎癥小體信號已被證明在減輕敗血性休克、腹膜、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、T2D、多發性硬化、和痛風等疾病中有效。因此NLRP3炎性小體是治療多種炎性疾病的一個極好的靶點。

利用CRISPR/Cas9在基因組水平上直接破壞關鍵分子-NLRP3，不僅可以完全抑制NLRP3炎癥小體的激活，還可以避免抑制抗炎生物制劑和抑制劑的脫靶途徑的潛在風險。研究CRISPR/Cas9敲除NLRP3的策略有望成為治療多種炎癥性疾病更有效的方法。

在這項研究中，研究者報道瞭一個系統的傳遞系統CRISPR/Cas9將mCas9和gNLRP3封裝進CLAN中。CLAN是一種以PEG -b- PLGA為基礎的納米顆粒，輔以陽離子脂質BHEM – Chol，用於核酸治療的遞送。在之前的工作中，研究者們已經將小幹擾RNA、RNA適配體和乙肝病毒CpG導入腫瘤細胞、心肌細胞、巨噬細胞或漿細胞樣樹突狀細胞CLAN。

然而，mCas9/gNLRP3不同於其他核酸療法，納米顆粒的性質影響給藥效率。為檢測CLAN42是否能有效遞送mCas9/ gRNA，研究者將Cas9和增強綠色熒光蛋白(EGFP)共表達mRNA (Cas9-EGFP mRNA，或mCas9-EGFP)及陰性對照gRNA (gNC)封裝到選擇的CLANs(CLANmCas9-EGFP/gNC)中。用不同的CLANmCas9- EGFP/gNC轉染骨髓源巨噬細胞(BMDMs)。轉染組EGFP陽性的BMDMs百分比最高。接下來，研究者通過轉染穩定表達GFP (Raw264.7-GFP)的Raw264.7細胞(巨噬細胞系)和包裹mCas9和gRNA靶向GFP (gGFP)的CLAN(CLANmCas9/gGFP)檢測基因敲除效率。轉染組中gfp敲除(KO) Raw264.7-GFP細胞比例最高，達53.9%。研究者通過向小鼠註射不同的CLANmCas9- EGFP /gNC進一步證實瞭CLAN42的體內mCas9/gRNA傳遞效率。註射組EGFPpositive腹膜巨噬細胞的百分比最高(48.4%)。綜上所述，由於其巨噬細胞攝取能力最強，所以在mCas9/gRNA傳遞中，CLAN42是最有效的，並且CLAN42更適合包封mCas9/gNLRP3(記為CLANmCas9/gNLRP3)用於多種炎癥性疾病的治療。

因此，研究者通過調整聚合物中陽離子脂質BHEM-Chol的重量和PEG5K-b-PLGA11K的質量分數，建立瞭不同表面電荷和PEG密度的基團庫。研究者在體外和體內都篩選瞭傢族，並選擇瞭一個更好的傢族來將mCas9/gNLRP3導入巨噬細胞中，通過破壞巨噬細胞中的NLRP3來改善膿毒癥休克，mCas9/gNLRP3誘導的腹膜炎和HFDinduced T2D。研究為CRISPR/Cas9進入巨噬細胞和治療多種炎癥性疾病提供瞭一個有前景的策略。

研究結果證明瞭CLANmCas9/ gNLRP3是一種很有前途的治療NLRP3依賴性炎癥性疾病的方法。研究也為通過納米顆粒介導的免疫細胞基因編輯治療免疫相關疾病提供瞭一個范例。